Єдиним театром, де Лесь Курбас поставив виставу як запрошений режисер, був театр ім. Марії Заньковецької. Родовід цього колективу відстежується з вересня 1917 року — саме тоді в Києві з’явився Український національний театр (УНТ), до створення якого на початковому етапі теж був причетний Курбас. У 1918 році УНТ, що виступав у Троїцькому народному домі (нині Національний театр оперети), урядовим рішенням перетворили на Державний народний театр (ДНТ). Його очолив Панас Саксаганський, основу трупи склали Марія Заньковецька. Любов Ліницька, Ольга Полянська, Варвара Любарт, Лазар Шевченко, Григорій Маринич, Борис Романицький. Серед прем’єр – першовтілення українською мовою драми Ф. Шіллера «Розбійники» (реж. Панас Саксаганський).
Після чергової реорганізації (1919) колишній УНТ-ДНТ став називатися Народним театром Троїцького народного дому. У серпні 1922 року урядовою постановою його знову перейменували та змінили керівництво. Новий сезон колектив розпочав 15 вересня 1922 року (вже як театр імені Марії Заньковецької) прем’єрою «Лихоліття» Гната Хоткевича. Художнє керівництво здійснювали Олександр Корольчук і Борис Романицький, до акторського складу увійшли Марія Заньковецька, Іван Мар’яненко, Северин Паньківський, Любов Ліницька, Варвара Любарт та ін., режисером призначили Панаса Саксаганського, художником – Івана Бурячка.
3 листопада 1922 року в театрі ім. Марії Заньковецької відбулася прем’єра Шевченкових «Гайдамаків» — фактично поновлення Курбасової вистави 1920 року, що йшла в театрі ім. Т. Г. Шевченка. Від попереднього спектаклю зберігся основний принцип оформлення (худ. І. Бурячок) та музична партитура (Р. Глієр, Н. Пруслін, К. Стеценко). «…Прикликавши Леся Курбаса до режисерської роботи над “Гайдамаками”, театр ім. Заньковецької, безумовно, зробив прекрасне починання. В курбасівській інсценівці Шевченкової поеми є якраз ті елементи динаміки, умовного трактування типів і положень, ритмічності сцен, яких не вистачало старому українському театру», — писав тогочасний рецензент.
З 1923 року театр став мандрівним: гастролював у Чернігові, Полтаві, Кременчуці, Черкасах. Протягом трьох сезонів (1924–1927) постійно працював у Катеринославі (нині м. Дніпро). Серед найкращих вистав цього періоду можна виокремити шекспірівського «Отелло» (реж. П. Саксаганський). З 1927 року театр знову гастролював, а в 1931-му став стаціонарним і перебрався в Запоріжжя. У його репертуарі переважала радянська драматургія. Постановникам вистав були Борис Романицький, Іван Богаченко, Іван Чабаненко та ін., провідними акторами — Варвара Любарт, Василь Яременко, Дмитро Дударєв, Володимир Данченко.
1941–1944 роки театр перебуває в евакуації, а з осені 1944-го розпочинає роботу у Львові. До трупи приєднуються актори-галичани, серед яких Іван Рубчак, поруч із яким Курбас робив перші кроки на професійній сцені. З 1948 до 1965 року головним режисером театру був учень Леся Курбаса Борис Тягно. Серед його знакових вистав — «Сон князя Святослава» І. Франка, «Гамлет» В. Шекспіра, «Фауст і смерть» О. Левади, серед важливих організаційних починань — активізація діяльності акторської студії, де дотримувалися принципів акторського виховання Леся Курбаса.
З початку 1970-х років естетичні засади колективу оновлюються. 1971–1978 року головним режисером театру працює Сергій Данченко. Значними віхами цього періоду стали постановки Данченка «Камінний господар», «Ричард ІІІ», «Украдене щастя»; «Сестри Річинські» і «Марія Заньковецька» в постановці О. Ріпка, «Дами і гусари» (реж З. Хшановський). Провідними акторами театру стають Лариса Кадирова, Любов Каганова, Богдан Козак, Таїсія Литвиненко, Федір Стригун, Богдан Ступка.
З 1987 до 2019 року театр очолював Ф. Стригун. Серед його прикметних постановок — «Народний Малахій» М. Куліша, «Наталка Полтавка» І. Котляревського, «Хазяїн» І. Карпенка-Карого, «Ісус, син Бога живого» В. Босовича. У 2002 році театрові присвоєно статус національного.
